关键词/肿瘤早筛单细胞测序 文/基因慧
循环肿瘤细胞（CTC）是在肿瘤发展过程中侵入血液循环的肿瘤细胞，与肿瘤转移和预后密切相关。以往对于肿瘤的研究多针对细胞群，忽略了细胞的异质性，导致遗漏部分生物信息。随着单细胞测序技术的成熟，针对CTC的研究对于癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗将具有重要意义。在本文中，CSCO常委王杰军教授为读者简要介绍了CTC的广阔前景。
王杰军教授
主任医师，教授，博士研究生导师，医学博士，国家卫生计生委肿瘤合理用药专家委员会副主任委员、中国临床肿瘤学会肿瘤支持与康复治疗专家委员会主任委员、中国抗癌协会癌症康复与姑息治疗专业委员会（CRPC）前任主任委员、中国生命关怀协会副会长、中国临床肿瘤学会（CSCO）常委、中国人民解放军肿瘤专业委员会顾问、上海抗癌协会副理事长、上海市防癌抗癌事业发展基金会副理事长、国家药物食品监督管理局药物审评专家委员会委员
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肿瘤治疗进入精准医学时代，对肿瘤组织的基因突变情况进行检测，对治疗治疗和预测预后至关重要。但是临床上多数肿瘤的组织获取存在问题且无法常规检测，严重地影响肿瘤的精准治疗。如何通过外周血，开展肿瘤的无创诊断和指导治疗一直是研究的热点。
肿瘤无创诊断技术即液体活检（liquid biopsies）入选《科学美国人》2017年度全球十大新兴技术榜单，与传统的组织活检相比，液体活检具备实时动态检测、常规的追踪分析癌症演化、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。
目前，临床研究中，液体活检主要包括游离循环肿瘤细胞（CTCs）检测、循环肿瘤DNA（ctDNA）检测、外泌体及循环RNA（Circulating RNA）检测等，与传统的依靠临床症状或影像学诊断技术比较，利用液体活检技术可以更早地发现疾病进展，而其中又以活体CTCs可得到的资讯最为全面完整、应用最为广泛。
南京怡天生物科技有限公司拥有两项独创专利技术：
1. A+QTTM系统可在35分钟内将5mL全血中的CTC以免抗体无损细胞活性的方式高效地筛选出来；
2. A+SCDropTM系统可将多样化细胞样本进一步转化为单细胞样本，且同时移除所有白细胞，进而利用单细胞测序进行更为精准的基因检测，快速筛选出患者是否携带突变基因，以求为患者提供最佳的治疗方案，辅助精准化个体治疗。
由于这两大体系均以非破坏性且不使用抗体和任何标记的纯自然物理方式，捕获的CTC可以维持原始样本活性且保有完整的基因信息，因此可用于后续的单细胞全基因测序、DNA甲基化检测、基因拷贝数变异分析、RNA测序等，进一步辅助患者的个体化治疗。
图，单个循环肿瘤细胞的基因组测序分析流程
A+QTTM运用可量产的微流体晶片技术来捕获血液样本中的少量肿瘤细胞（3－100CTCs／５ｍＬ），可移除99.99%的白細胞，不需要抗体与荧光标记，也不需要对样本进行任何处理，因此成本可以大幅降低，细胞的原始信息也可完整保留，且样本CTC收集捕获的时间大幅缩短（＜35min）。由于全程无需专业的生化人为操作且大多数时间皆为自动化程序运行，不同的人员操作也不会存在太大的差异。由于细胞的原始信息可以完全完整保留，因此对于后续的分析研究也有一定的价值。更重要的是，南京怡天生物科技有限公司开发的两套富集与两套单细胞分离与捕获技术完全不受表面抗原的表达情况而影响捕获稳定性。
A+SCDropTM是利用油包水(water-in-oil)的乳化技术结合高速细胞介电特征分析技术。此晶片系统可将A+QTTM富集后的产物样本，分成数百万颗0.1 nL的极小液滴，由于全血经A+QTTM富集后的样本仅剩CTC与数万颗WBCs(~104 WBCs/0.5 mL)，因此每颗小液滴中最多仅会存在一颗细胞，再由具独创专利技术的的高介敏介电特性侦测系統，深度分析液滴中的介电特征，可精准分辨空液滴、包覆WBC的液滴、包覆CTC的液滴等，5 mL全血经A+QTTM (>85%)+ A+SCDropTM(>70%)系统后，可捕获近7成的单细胞CTC液滴，仅低于5颗以内的WBCs可能会被误判(本系统80%以上的实验数据WBCs均在3顆内)，侦测后的单颗CTC可由本系统的自动化平台连动的分派入各自独立的单一反应小试管内，进行100% CTC丰度的全基因扩增。由于本系统所有机制(富集、单细胞分离、侦测、分选)均为纯自然物理的机制方法，无损细胞活性，实验数据结果显示，经本整合系统取得的单细胞全基因扩增(WGA)成功率高达80%以上，相比于现有市面上的单细胞捕获平台(存在染色或化学性破坏)，大幅提升了超过30%以上的WGA成功率。此平台相关技术已申报13项国内外专利。
该项技术已经在临床开展小型的研究，结果令人满意，临床专家正计划对进一步开展大型的研究。
患者1
· 大肠癌转移肺癌
· 5 single CTC sorted
结果如下：
患者2
· 肺癌患者
· 19 single CTC sorted
结果如下：
王杰军教授指出，肿瘤的精准治疗是成功治疗肿瘤的关键，精准的诊断是精准治疗的前提，通过技术手段，解决肿瘤组织获取的难题是目前临床研究的关键热点。液体活检技术这些年来突飞猛进，给精准治疗的实现带来了更有效手段。肿瘤的异质性是肿瘤治疗失败的一个极其主要的原因，如何更好地识别肿瘤的异质性问题，CTC的单细胞测序将是解决这个问题的关键，以单个细胞的视角对全基因组进行分析不仅更为准确，而且能够更好地指导癌症患者治疗策略的选择。这个技术已经获得突破，核心技术已经获得了近20项的专利，期待这项新技术尽快推向临床，可以建立精确的肿瘤谱，甄选出对特定药物有效的患者亚群，进一步有效指导肿瘤患者的个体化治疗。
编者：Candice 校对：Eric 审核：Mark
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