技术 | 遗传筛查开启单细胞时代《Nature Method》

关键词:遗传筛查

单细胞RNA-Seq测序 CRISPR

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图:细胞示意图,来自www.youdobio.com

33年前,一个1岁半的小朋友骨折,后来骨折了很多次,直到16岁那年才确诊为成骨不全症,又过了4年,小姑娘在北京上学找到大夫,大夫告诉说有一种双磷酸盐类药可以帮助这种病,但,在18岁之前服用更有效。对于疾病,尤其是7000余种罕见病,由于发病率低,诊断相对复杂,但对于超过1600万的罕见病人群,但如果事先经过遗传筛查,将有助于提高生存质量和解决疾病的概率。

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遗传筛查从筛查的时间段来看,主要对于孕前(夫妇)、产前(夫妇)、新生儿、其他阶段的人群筛查,主要针对DNA或者染色体变异导致的遗传性疾病,及早了解、预防和干预。

对于每个阶段的遗传筛查的范围,尚没有严格标准的规定。但随着基因检测技术,特别是第二代高通量基因测序(NGS)和基因芯片(Array)的技术的发展(单项疾病筛查可低至几十元),临床科室和第三方检测机构的合作、科研单位和医疗机构的转化渗透,使“筛查”的手段达到分子层面,受众普惠到大众人群。

但常规的测序技术受到一个因素的影响——细胞的异质性,即因为生物本身和环境变化等,即使是来源同个个体的细胞在分子生物学、表型、功能等方面均存在一定差异性;另外,某些特定类型的细胞数量比较少,比如胚胎细胞、干细胞等,难以满足常规测序要求,因此,研究人员早在2013或更早时候开始探索单细胞测序技术。

而近期,发表在3月1日《Nature Method》上的一篇文章表明,遗传筛查进入单细胞时代。文章提到,最近的四项研究利用单个细胞作为微扰实验室,分别开发出CROP-seq,PERTURB-seq,和CRISP-seq方法,克服了现有筛选方法的局限性。

这些方法主要包括两个主要策略,用于将遗传物质的变化与细胞表型相关联。

  • 一是在微孔板中的细胞上进行的芯片筛查(arrayed screen),每个微孔中引入单次遗传变异,提供成像,转录水平和蛋白质水平的信息,缺点是成本高、对于操作人员要求高,需要大量在培养基中增值的细胞进行分析。
  • 二是在单个细胞样本中平行、快速筛选数千个遗传变异的混合筛查(pooled screen),通过对遗传变异与单个表型(例如细胞存活)相关联进行排序。缺点是,不会显示每个变异的详细类型,存在较高的假阳性率,需要额外加以筛选。

CROP-seq,CRISP-seq和PERTURB-seq组合了两种类型的筛选的优势,并结合CRISPR-Cas9 系统,通过使用单细胞RNA-seq(scRNA-seq),同时测量每个细胞的遗传变异和表型(如下图),此外,研究小组开发了线性回归模型进行修正。

图:使用CRISPR和单细胞RNA-Seq的高通量遗传筛查

这些平台的一个优点是,全转录组测序提供了“普遍适用”(one-size-fits-all)的方案,同时测定很大范围的表型,而不依赖于生物标志物。这个防范还结合了CRISPR-Cas9系统的模块化和灵活性,其可用于除删除、基因沉默(CRISPRi)或激活(CRISPRa)。

Adamson等人使用靶向多达18,905个基因的文库证明了CRISPRi的稳健性和可扩展性,Dixit等人所证明的,他们分析了超过200,000个个体细胞显示单细胞转录组的可扩展性。Datlinger等人和Jaitin等人研究发现,大约30个细胞和50-100个细胞分别足以捕获每个变异极其表型。

尽管存在一定限制,CROP-seq,CRISP-seq和PERTURB-seq的简单性以及可扩展性展现出广阔的应用前景。

附:

  • CROP-seq主要思路示意图

图:Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout  (Nature Methods 14, 297–301 (2017))

  • CRISP-seq主要思路示意图

图:Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPRPooled Screens with Single-Cell RNA-Seq (http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.039)

  • PERTURB-seq主要思路示意图

图:A Multiplexed Single-Cell CRISPR Screening Platform Enables Systematic Dissection of the Unfolded Protein Response (http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.048 )

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参考:

1)Daniel E Wagner & Allon M Klein Nature Methods 14, 237–238 (2017)

2)Datlinger, P. et al. Nat. Methods 20, 297–301 (2017).

3)Dixit, A. et al. Cell 167, 1853–1866.e17 (2016).

4)Adamson, B. et al. Cell 167, 1867–1882.e21 (2016)

5)Jaitin, D.A. et al. Cell 167, 1883–1896.e15 (2016).

6)生命科学研究已进入单细胞测序时代

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