临床基因检测第一关,把好测序文库质量关

图:质控(来源/官网)


随着下一代测序技术(NGS)的成熟及基因测序成本的降低,NGS使用范围已扩展到孕前、产前、肿瘤筛查、用药指导、预后监测等临床及科研的诸多方面。健康所系,性命相托,在NGS标准和规范还没有完全统一情况下,质量控制显得尤为重要,而测序前的NGS文库质控是第一关。


2010年,原卫生部发布《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》,标志着我们临床基因扩增实验室开始纳入规范化和标准化。其中实验室质量保证体系是测序、数据分析、结果报告的基础和重中之重。

国家卫生健康委员会临床检验中心李金明主任曾谈到,没有精准检测就没有精准医疗,精准检测的第一步是实现质量控制与标准化。

在中华医学会主办的《中华医学杂志》发表的《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》中,明确提出“应对抽提后和文库构建后的核酸样本进行质控”。

目前,为了确认NGS文库的大小分布,一般使用琼脂糖凝胶电泳和微流控片段分析仪作为主要手段。为了确认浓度,还需要配备实时荧光定量PCR仪和Qubit荧光定量仪。对于一般医生而言,从文库制备到质量控制的操作是一系列复杂的手工作业。而且单样本的两项质控的总体成本高,是临床基因检测应用的第一步痛点。

厚泽生物推出的Qsep全自动毛细管电泳仪,可以以较低的成本完成对文库片段大小及浓度的质控,且灵敏度高,可准确地检测接头残留情况,是现在NGS实验室值得考虑的质控技术。Qsep可以得到与某知名品牌微流控电泳技术质量一致的质控结果(见图1),且其检测成本远低于该知名品牌。


图1:左,Qsep100的文库质控结果;右,某国际知名品牌的质控结果(来源/厚泽生物,下同)


近日,上海第二军医大学附属长海医院和复旦大学联合发表在GUT上一篇名为“Plasma extracellular vesicle long RNA profiling identifies a diagnostic signature for the detection of pancreatic ductal adenocarcinoma”的文章,其中文库质控采用的正是Qsep100全自动毛细管电泳仪。


一 、cfDNA和ctDNA检测的文库质控

随着肿瘤液体活检越来越广泛应用到临床癌症辅助诊断、用药指导等, cfDNA和ctDNA检测成为各肿瘤基因组公司的主流技术。而测序之前cfDNA和ctDNA检测主要是看两点,一是主带分布是否在160-180bp,二是是否有大片段残留等等。

图2:左,Qsep100的cfDNA质控结果;右,某国际知名品牌的质控结果


毛细管电泳仪可轻松快速获得核酸片段分布的峰图及所检出的核酸条带的bp大小,直观且准确。如图2,以Qsep为例,高敏卡夹的灵敏度比某国际知名品牌的高敏试剂更高。


二、Total RNA的文库质控

除了变异检测,基因表达在临床基因检测中应用也非常广泛,特别是寻找具有差异表达的基因靶点,肿瘤转移监测等。Total RNA测序是基因表达的主流技术之一。

针对Total RNA的质控,可根据毛细管电泳仪给出的直观的RNA quality number来判断样本的质量。澳大利亚的柏格霍夫医学研究所在Parasites & Vectors上曾发表文章“Gene silencing by RNA interference in Sarcoptes scabiei: a molecular tool to identify novel therapeutic targets”,其中RNA质控采用的就是Qsep100全自动毛细管电泳仪。

图3:左,Qsep100的Total RNA质控结果;右,某国际知名品牌的质控结果


如图3,以Qsep为例,RQN值是对28S和18S质量及浓度评估后的反应,根据不同的建库要求,对RQN值的大小也有相应要求,在达到相同检测水平下,Qsep毛细管电泳技术检测成本低于其他全自动设备,在RNA检测中有广泛应用,医院的客户可以应用于生物样本库里不同RNA标本保存情况的检测。

三、小片段核酸(mRNA,外泌体RNA)的文库质控

目前提取的核酸种类,已由常规的Total RNA、DNA和蛋白质,扩增到各类新兴的小片段核酸的提取,例如mRNA,外泌体RNA等等。此类样本的核酸提取试剂盒非常多,但由于本身含量低,加上抽提过程中的损失,如何完美地完成低浓度核酸样本的质控显得尤为重要。


图4:mRNA(来源/网络)


mRNA(message RNA),由DNA转录而来,是蛋白质合成的模版,目前在无创液体活检领域正受到越来越多的重视(见图5)。此外,Exosome (外泌体)中的mRNA、miRNA和Protein有望成为多种疾病的早期诊断标志物。


图5:mRNA的质控(毛细管电泳结果)


Exosome (外泌体)是活细胞分泌的直径约为30-150nm的膜性囊泡,天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳。Exosome的定性和定量研究正处于快速发展阶段,同时,循环生物标志物的市场也存在着机遇和挑战。


不过,无创产前检测技术的成功让人们相信,循环生物标志物有望在肿瘤及其他疾病的诊断上发挥作用。但外泌体抽提的mRNA或miRNA浓度极低,需要高灵敏的仪器进行检测,毛细管电泳可达到所要求的灵敏度,而且分辨率高,可以完美完成低浓度外泌体样本的质控。(见图6)。


图6:外泌体RNA的质控(毛细管电泳结果)


四、实现高通量测序临床有效应用,质量当先

二代测序技术(NGS)的诞生是对传统测序技术的一次革命性改变,NGS作为一个强大的功能平台,可以同时对多个样本数以万计的DNA分子进行测序,目前NGS使用范围已扩展到孕前、产前、肿瘤筛查、用药指导、预后监测等临床及科研的诸多方面。

为了促进NGS临床应用,提升业内人员的NGS建库技能与质量控制,由中国遗传学会遗传诊断分会、上海市遗传学会主办,上海市临床检验中心、遗传工程国家重点实验室承办,并由厚泽生物等单位支持的“第二届NGS建库技能大赛”已于2019年5月10日正式启动。理论知识竞赛将于12月28日正式开始(目前现场操作技能比赛已于11月9日顺利完成),届时将根据现场操作技能比赛和理论知识竞赛的综合成绩角逐出最终比赛结果。


厚泽生物作为第二届NGS建库技能大赛的支持单位,独家提供NGS质检仪器Qsep100,并为现场操作技能比赛和理论知识竞赛等各方面给予了协助,并将一如既往的支持国内各检测机构提高NGS检测质量,促进NGS质检的更高标准化进程。

正如国家卫生健康委员会临床检验中心李金明主任所言,实现高通量测序临床有效应用,首先要实现NGS性能确认,这是临床有效性(Clinical validity)、临床有用性(Clinical utility)和临床预期用途的前提。守好测序前的文库质量关,是临床基因检测的第一步托付。


 【关于厚泽生物 】厚泽生物科技有限公司是一家集科学仪器、耗材、试剂的销售、推广和售后服务为一体的高科技生物企业。公司成立于2013年6月,总部位于杭州,在北京、上海、广州、成都等大型城市设立办事处。以“用户至上,用心服务”为核心价值,以技术为基础,以品质求发展,服务国内外科研院校、检测机构等合作伙伴。联系方式:0571-81060645


(封面图来源/网络)

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2019年第二届全国NGS建库技能大赛

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