仅需45分钟!Nanopore测序实现HPV&宫颈微生物组同步检测

来源/元码基因  编辑/基因慧

 

图1:HPV病毒(来源/互联网)

元码基因科学团队采用三代测序技术,快速至45分钟就可获得宫颈处前十种主要微生物与HPV的信息。研究成果已于北京时间12月19日在Scientific reports (IF=4.122)以题目“Simultaneous detection and comprehensive analysis of HPV and microbiome status of a cervical liquid-based cytology sample using Nanopore MinION sequencing”刊出(点击文末“阅读原文”可见)。


人体内环境是复杂的大自然中一个相对独立的小环境。在这个小环境里面有大量的微生物与我们生活在一起,其中有益生菌保护我们,也可能有病原菌伤害我们。体内微生物菌群的变化可能引起某种疾病,同时身体状态也可能反过来作用于菌群。人类乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是引起宫颈癌的主要病原生物,同时宫颈癌的发展可能与宫颈处微生物群落结构变化有关。

然而,市面上目前还没有一种可以同时快速检测HPV病毒和其他微生物的方法。因此,我们需要更好的工具对HPV等微生物进行区分鉴别分析。

针对这个问题,元码基因科学团队采用多重 PCR技术和Nanopore测序,只需花费 45分钟,就可以同时得到宫颈处前十种主要微生物与 HPV的信息。具体的方法,采用多重 PCR技术扩增 HPV E6&E7 区域以及 16s 全长,并对扩增产物使用Nanopore进行测序。

经验证,其分析结果与 Illumina 测序平台检测结果一致,但花费的时间大大缩短。


图2:该项研究成果已在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出(来源/元码基因,下同)

该项研究成果已于北京时间12月19日在Scientific reports ( IF=4.122) 上刊出,是目前第一篇用ONT单分子测序平台同时快速检测HPV感染和宫颈微生物组的文章。


一、微生物群落结构
【具体方法】元码基因团队分别采用Nanopore和Illumina测序平台对微生物进行16s扩增子测序。
■ Nanopore测序平台
测序多重PCR产物,引物分别为16s全长与HPV E6&E7 区。

 Illumina 测序平台

只检测16s V4区产物。

 比对和注释

Nanopore测序数据先与HPV基因组数据库比对,得到的HPV信息作为分型鉴定的辅助依据。对于没有比对上HPV的测序数据,继续进行微生物物种注释流程。


16s 分析结果显示,Nanopore测序平台检测到丰度前十种微生物在不同分类水平与Illumina测序平台一致。低丰度的rare genus种类数量,Illumina平台检测到的比Nanopore平台多,其原因可能因为Illumina平台测序深度远大于Nanopore平台。

 

图3:不同分类水平的物种注释(a,门水平;b,纲水平;c,目水平;d,科水平;e,属水平)

此前已有文献报道,同一批次测序数据如使用不同的分析方法则会产生不同的结果。这其中,比对方法与使用的数据库有很大的影响。基于此,采用了不同的方法与数据库分别对Nanopore测序样品进行分析。


■ 采用不同方法与数据库对Nanopore测序数据进行分析:1)传统方法 QIIME + greengenes 数据库;

2)Nanopore测序常用比对软件 LAST + greengenes 数据库;
3)Nanopore测序常用比对软件 LAST + NCBI 16s 数据库。

图4a:不同分析方法的比较图;4b 高丰度物种的亲缘关系

文氏图(图4a)为三种方法在属水平上物种注释结果的比较,三种颜色的圈分别代表三种方法,中间的10表示三种方法检测结果共有10个属,其正好是丰度前十的微生物,说明 Nanopore 16s 全长测序结果具有很好的 robust 性。

NCBI 数据库相比greengenes 数据库具有一大优势,它可以注释到种水平,在后续临床应用中可以为医生提供更多的信息。系统发育树(图4b)为注释到种水平的微生物以及进化关系,包含了丰度前十的十个属。


二、快速检测

按照不同的百分比随机抽取Nanopore reads,以此模拟不同测序时间的注释结果,每个百分比分别随机抽取十次。

■ 数据抽取之后的分析结果表1

第一列:抽取reads的百分数;
第二列:测序的时间;
第三列:抽取的reads数;
第四列:抽取的reads中16s平均reads数;
第五列:抽取的reads 中 HPV平均reads数;
第六列:微生物丰度前十的平均reads数;
第七列:支持reads大于4时检测到全部丰度前十的次数;
第八列:每次随机抽取后与全部测序reads群落结构的相似程度。

从中可以看出,只需测序45分钟就可以得到完整的微生物群落结构以及HPV信息,与MiSeq PE250大于24小时测序时间相比大大缩短。

表1:随机抽取测序数据的分析比较


三、元码基因依托技术平台优势

这项技术具有实验步骤简单、易于操作且花费时间短的优势。应用到临床检测时,可以大大减少患者等候结果的时间。

如果检测结果与自动化报告系统联用,在检测结果得出的同时,可以给医生提供相关微生物的信息,辅助医生针对每个患者个体制定个性化治疗方案。

同时,Nanopore的flowcell可以短时间内不同批次重复使用,无需等待大量患者样品就可以测序分析。这个优势能够大大降低检测成本。

因此,元码基因通过同时检测HPV病毒感染和宫颈微生物组(感染或者菌群失衡)的方式,解决了疑似感染者对快速检测的需求,把单分子测序的能力发挥了出来。

展望未来,这项技术的普及就可以让更多的患者受益于“高质量、低价格、快时间”的个性化诊疗。



参考资料:

[1] Rebolj, M. et al. Primary cervical screening with high risk human papillomavirus testing: observational study. BMJ 364, l240 (2019).

[2] Gao, W., Weng, J., Gao, Y. & Chen, X. Comparison of the vaginal microbiota diversity of women with and without human papillomavirus infection: a cross-sectional study. Bmc Infectious Diseases 13, 271–271 (2013).

[3] Arokiyaraj, S., Seo, S. S., Kwon, M., Lee, J. K. & Kim, M. K. Association of cervical microbial community with persistence, clearance and negativity of Human Papillomavirus in Korean women: a longitudinal study. Scientific reports 8 (2018).

(封面图来源/元码基因)


 【关于元码基因 】
元码基因是一家集精准医疗新技术研发、产品转化和基因检测服务为一体的高新技术企业。聚焦于搭建临床肿瘤精准医疗平台,致力于将先进的基因组学技术应用于临床实践,为用户提供更可靠的精准医疗解决方案。依托完整的技术平台,在肿瘤领域成功推出济康、济克、济安系列肿瘤产品线。涵盖肿瘤早筛早诊、精准用药和实时监控的全时段管理,最大限度地满足不同阶段肿瘤患者的需求。此外,自主研发出UCap、DeCap、TCap、PCap核心技术,以及“10K”系列液体活检产品,实现肿瘤无创检测,并率先提出“四定液体活检”(“定量”、“定性”、“定位”、“定序”)的新一代液体活检理念,为临床无创肿瘤基因检测开启了全新模式。

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