ACMG发布panel最新标准规定(从设计到报告)

原创:ACMG    转载:华大医学
由于不同实验室对panel的基因选择逻辑、基因与疾病的关联程度、基因捕获深度等都存在差异,导致不同实验室的panel设计差异较大。近日美国医学遗传学与基因组学学会 (ACMG) 在Genetics in Medicine杂志发表文章,主要就诊断类基因panel从设计到报告提供统一的技术标准进行论述。

发表时间:ACMG Technical Standards|Published: 16 November 2019


 方法:ACMG工作组收集整理并评估有关基因panel设计和报告的建议,完成草案后提交ACMG董事会审核和董事会成员校稿评论,之后放到ACMG网上并邀请ACMG成员进行校稿评论,最后集合各专家的意见修改成文。本文旨在作为诊断类基因panel从设计到报告的通用技术框架。


 几个重要概念:▲ Diagnostic gene panel:诊断类基因panel,适用于临床诊断 (有明确疾病指征),不适用于筛查 (携带者筛查等没有指征的测试)。 GADGene associated with Mendelian disorder,孟德尔遗传病相关基因,参考ClinGen的标准,至少需要中等以上证据强度的基因。▲ GUS:Gene of uncertain significance,临床意义不明基因,在ClinGen标准中与疾病相关性有限或者有争议的基因。


 摘要:

▲ 工作流程:确定panel用途→选择基因 (疾病对应的GAD/GUS、鉴别诊断基因),得到候选基因list→评估和修改基因列表→得到最终基因list→确定检测方法→生成panel报告 评估和修改基因列表:• 与疾病的关联度• 技术参数 (覆盖度、GC含量等)• 常见致病变异• 待测变异类型(是否删减基因或删减基因检测范围或补充其他检测方法) panel报告:

• 检测panel基本描述

• 检测基因描述

• 检测方法

• 检测局限性


 panel设计要点:• Phenotype-directed diagnostic gene panels (表型指导的诊断基因panel)• Clinical sensitivity (临床敏感性)• Clinical specificity (临床特异性)• Clinical validity (临床有效性)


 表型指导的基因诊断panel: 一些不适当或不必要的基因 (如:GUS) 可能会引入很多临床意义不确定的变异 (VUS)。临床意义不确定的变异 (VUS) 可能给患者带来困扰,反而给临床造成麻烦。因此,需要根据panel用途权衡GUS的意义和成本效益,合理的增减与分析GUS可在最低成本的基础上最大程度地提高临床敏感性设计合理的panel符合以下条件:① 在特定临床适应症下有最优的成本效益;② 在一定范围内最大限度地提高临床敏感性,即应包括与疾病相关的所有GAD,并可以对具有临床异质性和重叠特征的疾病进行分子诊断。③ 包括有限的GUS,但GUS应该满足一定条件 (参见“临床敏感性”,“基因考虑因素”和“报告”中的示例);④ 通过限制或排除GUS来实现临床特异性的最大化,从而最大程度地减少检出的VUS数量。⑤ 对当前的测序技术无法检测的基因/区域采用辅助技术方法检测,以最大程度地提高临床实用性


 临床敏感性:▲ 基因panel的临床敏感性主要受限于当前对基因-疾病关联的认识局限性和实验室检测致病变异的技术局限性。诊断类panel应包括所有GAD。尽管不鼓励在诊断类panel中广泛包含GUS,但部分被专家组推荐的GUS在特定条件下还是有意义的,如最新报道的与疾病有关的基因 (更多疾病相关证据可能很快出现)。如果专家组推荐的GUS为新报道的、与疾病相关性证据有限的基因,则必须满足一些其他报告要求 (请参阅“基因考虑因素”和“报告”)。此外,应对专家组推荐的GUS进行定期的评估和修订,包括但不限于与疾病专家进行探讨,定期进行文献查阅以及对特定基因的数据进行回顾分析。▲ 为了最大程度提高检测的灵敏度,应该考虑每一个基因的致病变异谱了解单核苷酸变异 (SNV),外显子内插入和缺失,基因内拷贝数变异 (多外显子CNV),重复扩增或结构畸变的致病变异报道频率。如果原panel技术方法检测范围不包含对临床敏感性有较大影响的变异,则应该补充替代检测方法。如果对于特定变异的检测在panel外另有检测项目供选择,则应该提供灵活的检测选购方案。如果辅助检测分析方法未被包含,则应公开检测局限性,并在panel报告和临床报告中提供辅助检测分析的建议。


 临床特异性:基因panel的核心在于能够将患者的特定临床特征与该表型相关的基因进行匹配。 尽管从技术上可以对所有与表型相关的基因进行测序,但基因panel的核心在于能够将患者的特定临床特征与该表型相关的基因进行匹配,从而提高临床特异性并限制VUS的数量。 具有极高遗传异质性的疾病仅用一项综合检测可能难以处理对于此类疾病,如果一线检测是非诊断性的 (未获得明确的诊断),则外显子组或基因组测序可能是更好的首选检测方法。但也得注意相反的极端,在某些情况下等位基因的特异性检测可能才是最有效的方法 (具有更好的针对性)。


 临床有效性:▲ 尽管遗传学界早已认识到需要建立一个标准来规范测序变异的临床解释,但将这种思维方式扩展到基因-疾病的关系最近才受到关注。▲ ClinGen正在努力推动确定基因-疾病关联的临床有效性标准,该标准将基因-疾病关联证据从“确定的”到“被反驳的”进行排序,遗传学界也正在将其纳入临床实践。▲ 在临床环境中进行测试,了解基因-疾病关联的有效性是选择合适基因的第一步。随着与疾病关联的证据减少,相应基因检测的临床效用也下降。▲ 实验室负责评估基因-疾病相关证据的强度,该证据强度可能限制了将变异分类为致病性或疑似致病的能力。例如,与疾病的关联性尚待确认的基因,基因-疾病关联的证据强度属于中等,那么对应基因上检出的功能缺失型变异,它的致病性等级也几乎不会超出疑似致病;对于一些基因-疾病关联证据是新发现的 (证据较弱且有限),那这些基因上检出功能缺失型变异的致病性等级一般不会超出意义未明。▲工作组推荐实验室综合利用ClinGen的基因-疾病关联证据等级和ACMG/AMP的变异致病性解读标准,并定期对基因-疾病的证据进行系统性回顾,以寻找是否出现新证据支持。▲ 对于诊断类的基因panel,首先应包括具有临床检验指征证据的GAD,其次则根据panel的预期用途选择基因 (例如:疾病诊断、疾病预测、携带者筛查)。如果panel包括用于探索性或科研目的的GUS,则还应满足对应的特殊要求。由于GUS没有/几乎没有临床有效性证据,因此包含GUS的panel应该在报告中加以说明。


 基因考虑因素:• Gene contribution (基因贡献度)• Differential diagnosis (鉴别诊断)• Incomplete penetrance and disease association (外显不全和 “是否孟德尔遗传疾病相关基因”)• Exclusion criteria (基因排除标准)


 基因贡献度:▲ 对于大多数遗传疾病,不同基因对疾病病因的总体贡献度不同。通常少数基因上的致病变异可能解释该疾病大部分的病因,而其他基因导致的罕见型仅占小部分病因。例如,在肥厚型心肌病 (HCM) 中,MYBPC3MYH7基因中的致病和疑似致病变异约占该病分子诊断的80%,而专家组为诊断出罕见的HCM,选择的基因list可能包含50多个基因。▲ 只要技术上可行,实验室都应设计包括一个所有GAD的通用基因panel和一个适用范围更小、包含更具体疾病的小panel。与疾病最相关的基因可能位于小panel中,而对疾病贡献度较小的基因则包括在通用panel中。对于无法准确评估对疾病贡献度的基因,如新基因 (例如证据有限但属于新发现的GUS)、罕见疾病的遗传基因 (如仅具有中等证据的GAD),实验室必须根据panel的预期适用范围及目的来评估基因的现有证据,并决定将哪些基因包括在检测中。


 鉴别诊断:▲ 临床敏感性最大化是设计panel的一种策略,考虑到鉴别诊断,对于与目标疾病临床表型重叠度大的疾病,其相关的基因也应该包含在panel的基因list中。此外,考虑到综合征疾病患者可能仅出现孤立的临床症状 (可能是尚未表现出年龄相关性的其他症状或临床异质性),因此,与综合征相关的基因也应该考虑放入特定表型特征的基因panel中。▲ 鉴别诊断中包括的基因应该是相关疾病的GAD (但可能存在临床特异性指征证据有限甚至是没有),在这些基因上检测到致病变异,则考虑对致病变异相关基因疾病的诊断可能。


 外显不全和 “是否孟德尔遗传疾病相关基因”:▲ 一些表型或综合征是由低外显的基因或变异引起。如果panel的基因设计考虑外显不全而将对疾病有重大贡献的基因排除掉,则可能出现漏诊。因此必须权衡此类基因对疾病的贡献与此类检测可能在患者和家庭成员之间造成不必要焦虑的风险。临床报告中必须明确解释变异不完全外显的证据。▲ 与非孟德尔疾病关联的基因又是另一项挑战。随着多基因疾病变异风险计算分析等临床有效性数据的积累,将此类非孟德尔关联的基因纳入诊断类panel可能变得可行;但是,要求这些数据必须清楚地与孟德尔疾病有关的基因和变异分开标识并加以描述。


 基因排除标准:▲ GUS通常不包含在panel候选基因中。但如果panel需要又包含了GUS,则必须区别分析GUS与GAD数据。从检测说明、知情同意、免责声明到报告信息都应明确表明一个或多个GUS基因 (疾病关联未证实的基因) 已被包括在内。▲ 如果panel基因是通过通路分析或其他没有有效疾病关联的预测分析得到的,应该采用如下标准:① 患者对测试的知情同意应类似于外显子/基因组测序或研究,以充分告知可能出现不确定性结果的情况。在报告系统允许的范围内,将GUS报告的变异与GAD报告的变异分开。如果不可能有单独的部分,则应将GUS的数据用单独的段落/文本描述。② 报告中GUS 的变异不应与特定的遗传疾病或遗传模式相关;相反,可以给出基因数据的简要摘要 (例如:描述为“已有文献/报道显示该基因的单个错义突变与一个家族中的[表型]分离,但是还没有足够的证据来确定该变异的临床意义。”)。


 技术注意事项:• Sequence limitations (序列局限性)• Pseudogenes and gene families (假基因及基因家族)• Mosaicism (嵌合性)• Transcripts (转录本)• Copy-number variants (拷贝数变异)


 序列局限性:高度同源区域、GC含量高和低的区域、重复序列区属于技术局限性,无法高可信度或高质量测序,这可能导致NGS的覆盖范围不足。因此,需要特别注意这些低覆盖/未覆盖区域的重要性 (根据基因证据进行评估)。应使用以下方法来处理这些区域:① 不能高质量覆盖疾病热点致病变异区域或变异类型时,应使用其他补充技术方案检测对应区域或变异类型,以确保足够的临床敏感性。② 如果实验室政策已包括对覆盖不足的重要区域进行补充测序,但对那些临床敏感性不是至关重要的区域 (例如作为鉴别诊断的基因,其对疾病贡献度不大的基因区域) 可能会从检测范围中删除。这种情况,需要在检测及报告中说明相关局限性。③ 针对特定的病例,一些未覆盖的区域必须以摘要 (例如描述未涵盖碱基的百分比) 或根据要求以详细信息进行披露告知。
(通过NGS技术进行的CNV检测可能包含在panel中,但如果未包括在内,则应将无法通过分析检测到的CNV致病变异的预期比例作为局限性进行披露告知)


 假基因及基因家族:▲ 在外显子和内含子区域具有同源性的重复序列或假基因常会干扰测序比对。▲ 如果存在假基因干扰的基因在病例解释中占很大比例,则必须采用辅助方法以确保临床敏感性。其中可能包括长聚合酶链反应 (long range-PCR) + 测序 (Sanger或NGS) 或旨在规避这些问题的新兴技术。如果不能被有效验证其真实性的NGS基因/基因区域,应当从panel检测范围中删除。


 嵌合性:对于最常见的致病机制是体细胞嵌合的基因,应在收样标准中说明首选的样品类型,并解释其他易取样本类型的检测局限性。如果实验室专门设计了一种能检测嵌合变异的检测技术,则必须在报告中对在平均覆盖情况下的最小检出阈值进行说明。


 转录本:美国病理学家学院 (CAP) 和分子病理学协会 (AMP) 工作组最近提供了转录本选择的评估指南:① 实验室应遵守本领域内有关转录本亚型的惯例,该惯例应支持许多出版物中使用的转录本,和/或基于同行评审的文献和特定于基因座的数据库而已知具有生物学相关性的转录本。② 确定使用的转录本在出版物或命名约定中是否存在重大差异,以确保生物信息学流程中能处理此转录本信息。③ 当上述基因转录本特征不充分时,转录本选择应包括所有出版物中使用的转录本号和版本,以确保能检测到所有已报告的致病变异。当有关基因的信息有限时,应使用能覆盖全部外显子的一个或多个转录本,选择最长转录本作为报告默认转录本。


 拷贝数变异:通过NGS数据来分析CNV的算法仍待改进,由于覆盖的深度与均匀性问题,CNV的假阳性可能很高。因此,对NGS检出的CNV必需进行验证确认其准确性。报告必须明确说明CNV检测的局限性,尤其是可以检测到的CNV大小 (表示为连续外显子的数量)。


 报告:ACMG提出了NGS报告的通用标准。由于绝大多数基因检测都是使用NGS技术进行的,因此在应用这些标准时需要考虑一些特殊的注意事项:① 测试名称及说明:实验室负责提供panel的有关预期用途 (临床适应症)、临床敏感性预期和特异性 (如果已知) 的摘要,以及包括的基因列表。检测信息应明确指出合适的临床适应症;是对较窄的亚组还是较宽泛的综合组进行检测;是否包含综合征和非综合征相关的基因;是否包括GUS。② 基因信息:基因官方命名 (或通用别名)、转录本、基因-疾病关联、遗传方式、是否外显不全。③ 局限性:检测所包括的内容和不包括的内容都应该是公开的。检测报告应在报告或报告摘要中列出低覆盖度/未覆盖的外显子区域,并提供如何获取详细信息的说明;清楚描述所使用的技术方法及相关局限性;实验室也有责任在免责声明或局限性描述的摘要或详细信息部分描述表现不佳或不一致的区域/外显子。此外,如果将特定区域或基因明确排除在检测范围之外也应该列举清楚;应该详细说明检测大片段缺失/重复和非编码变异的技术局限性。

 

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