方兴未艾,纳米孔测序技术最新前沿应用与技术动态

关键词/纳米孔测序技术  文/基因慧

2019年1月4日,《Science》刊登了新年首篇关于纳米孔测序技术应用的文章,研究人员通过小型便携式Oxford Nanopore MinION设备,对尼日利亚爆发的拉沙热疫情进行了动态实时的基因组监测,仅七周就完成了120名患者样本的宏基因组测序,揭示了病毒类型和传播途径等时间敏感的问题。纳米孔测序技术因其长读长、直接测序、实时、按需测序和灵活可拓展等优势(详情),在众多生命科学应用场景中广泛涉猎,仅2018年就有超过150篇相关文章发表。

图,2019年1月4日刊登在《Science》上的研究

文章目录如下:

一、纳米孔测序技术最新前沿应用

1. MinION 测序仪用于快速、实时监测疾病爆发,了解病原体感染

2. GridION和PromethION用于大型基因组测序和组装,解析结构变异

3. 直接RNA测序

二、纳米孔测序技术最新技术动态

1. R10 纳米孔

2. Flip-flop 碱基识别软件

3. 测序芯片更新:Rev D版本

4. PromethION x24 和 PromethION x48设备

5. MinION Mk1c

 
   

纳米孔测序技术最新前沿应用

   
 
 

MinION 测序仪用于快速、实时监测疾病爆发,了解病原体感染

 

在疫情流行期间绘制病原体的进化图谱,对了解感染传播模式和制定相应的控制方案至关重要。然而,相应的测序制库工作量大且耗费时间,从采样到获得结果的周期通常需几天到一周甚至更长。在这个时间敏感并关键的领域中,转移运输样本显得并不明智。

图,Oxford Nanopore测序仪器

不同于其他测序仪,MinION重量不足100g,是一款完全便携式测序装置,可通过标准航空公司进行装运。研究人员可实地进行分析,未来有望实现即时检测或远程检测(目前仅供研究使用)。较大型GridION和PromethION设备也可用于满足更大数量的样品测序。所有这些功能都使数分钟内完成病原体从采样到获得结果的常规诊断过程逐渐成为可能,且有效推进了传染性生物体的检测和抗微生物药物耐药性研究领域的发展。

 

公共卫生团队已使用纳米孔技术对狂犬病、拉沙热、黄热病、流感、登革热、疟疾、大肠杆菌、MRSA等疫情进行了研究,在疫情爆发初期迅速对病原体进行实时鉴定,可以使公共卫生官员做出恰当的响应并合理分配资源。

 

2018年8月,东英吉利大学的Justin O’Grady研究小组使用纳米孔测序技术快速鉴定出患者下呼吸道感染(LRTI)和耐药特征。LRTI是一种致命传染病,快速准确的检测对患者治疗和预后起到关键作用。相较培养法通常需超过48小时的典型反应时间,纳米孔测序可以将时间降至6小时以下,极大地缩短了等待时间。

在世界其他地方,英国牛津大学研究小组使用MinION实现了结核分枝杆菌种属的快速全基因组测序。通过实时纳米孔测序,结核病致病生物体的抗微生物药物耐药性分析所需时间从8-15周缩短到仅12小时。缩短时间的同时使得痰液样本分析更加灵敏,更具成本效益。

 

2018年,Oxford Nanopore发布了一款可以搭载MinION/Flongle使用的小型超级计算机——MinIT便携式分析仪。它比典型基于CPU的笔记本电脑快7倍,带有预配置的控制和分析软件软件,可实现实时、高通量的数据分析,可以在实验室环境中或更多自然环境下使用。研究人员使用MinION测序仪和MinIT便携式分析仪,面临白令海8级风暴的恶劣环境,在阿拉斯加海洋研究船上完成了对海洋微生物组的分析,在持续数周到数月的海上考察期间,检测分析得到的实时数据对理解海洋生物多样性具有很大帮助。在地球的另一边,位于东非的研究人员在坦桑尼亚一个小农场的树下使用MinIT和MinION进行实验,鉴定了重要的经济作物木薯携带的病毒,从样品到得出结果仅需三小时。

 

使用GridION和PromethION进行大型基因组测序和组装,解析结构变异

大多数基因组含有大量重复的DNA,如转座子和基因复制等,传统的短读长可能无法跨越每个给定的重复区域,产生的基因组组装可能高度片段化。在这一点上,长读长测序技术具有显著优势,其生成的读长更有可能跨越整个重复区域,从而将缺口最小化,实现基因组的准确组装。如同一个拼图,拼图组块越大,拼图越容易。测序读长越长,它与其他读长之间的重叠就越多。因此,将越容易将DNA片段组装回正确的顺序。与其它技术不同,纳米孔测序的读长片段不受测序仪的限制,2018年5月,英国诺丁汉大学的科学家Matt Loose打破了此前1Mb的读长记录,获得迄今为止最长的被连续测序的DNA片段,长度约230万个碱基。

 

2018年1月,《Nature Biotechnology》杂志发文,研究人员使用纳米孔测序技术完成了超长读长的人类基因组组装,在提高组装连续性的同时,还能解析大型的结构复杂区域,这也是迄今为止使用单一技术完成的最完整的人类基因组组装。2017年第一个纳米孔人类基因组发表时,研究者使用了MinION测序仪的许多测序芯片来完成。而如今,随着技术的不断发展和提升,相同的91.2Gb数据只需几张便携测序仪MinION芯片,甚至只要一张高通量测序仪PromethION芯片就能获得。

2018年3月《Nature Biotechnology》杂志发表加州大学圣克鲁兹分校Karen Miga博士领导的一项有关Y染色体着丝粒的研究,由于人类着丝粒由大量近似相同的串联重复组成,难以使用短读序列技术进行组装,该研究利用纳米孔技术产生的长读长,展示了使用纳米孔技术交付的首个完整和准确的人类着丝粒序列。2019年1月初《Nature Communication》的一篇文章展示了高度连续和完整的非洲起源的首个人类Y染色体组装,并将组装的连续性较之前的方法提高了800%以上。

 

2017年12月中国科学家宣布率先完成菊花的全基因组测序,纳米孔测序被用于进行从头测序和组装C.nankingense基因组。菊花基因组高度复杂,大小约3.07 Gb,具有高杂合性、高度相似的长重复序列,证明纳米孔测序技术能够提供大量的读长及直接测序数据。

Oxford Nanopore于2018年发布了高通量测序设备PromethION,可用于针对大型基因组和大型测序项目的长读长、直接测序。随着测序性能不断提升,目前已有科学家在单张测序芯片获得148Gb的测序数据, 内部测试中已获得220Gb。在2018年美国人类遗传学大会上,来自VIB的团队发布了首个使用PromethION进行的一个人类全基因组测序文章,标志着大型、可负担起的长读长测序已经到来。PromethION正在被越来越多的用于高影响力的项目中,包括种群规模的基因组研究,以及植物和人类基因组。

 

 

直接RNA测序

2018年初,首个RNA直接测序的文章荣登《Nature Methods》期刊封面,描述了无需进行逆转录或扩增步骤,允许生成全长、链特异性的RNA序列,修饰信息被完整保留的RNA纳米孔测序技术。2018年4月,美国疾病控制和预防中心(CDC)的微生物学家John Barnes率领研究团队,首次以其天然形式测序了完整流感病毒RNA基因组。在《Nature》杂志发表的新闻评论文章中,John Barnes表示:“这是第一次,我们真正开始观察基因组在原始状态下的本质,开辟了非常多的可能。

图,MinION已经在国际空间站上执行了纳米孔DNA和直接RNA测序。图片来源:Oxford Nanopore 技术原理手册

2018年9月,美国NASA航天局宇航员使用MinION首次在宇宙国际空间站完成了对RNA的直接测序,有助了解从微生物到植物再到宇航员等各种生物如何适应国际空间站的生活条件,改善宇航员健康状态。随后11月预印在《BioRxiv》的一篇里程碑式的文章中,研究者们使用纳米孔天然RNA测序进行了人类多聚腺苷酸尾(poly-A)转录组测序。

RNA测序是研究人类遗传学和疾病相关病理学的宝贵工具,近年在生物学、医学乃至农业环境中的各个领域都取得了前所未有的发展。由于传统测序方法进行的RNA测序分析需将RNA转化为互补DNA(cDNA)链,而并非所有的转录物都能以相同的效率扩增,这会导致一些种类RNA扩增中断,以及其它种类RNA的过度扩增,从而引入逆转录或扩增带来的偏好性。这些方法的局限性体现在获得全长转录物、问题异构体的识别和量化、文库构建相关的偏倚(PCR、逆转录等)等方面。

纳米孔测序能提供长读长在转录组分析中所占有的所有优势,生成全长转录本,适用于异构体以及丰度的精确鉴定。便携、快速的实验室制备步骤和实时分析流程,使得纳米孔测序在病毒性病原体研究领域,特别是实地作业环境中具有优势。无逆转录和PCR扩增偏倚的RNA直接测序的出现更是进一步推动了转录组学的分析。RNA直接测序还可以通过单个文库制备鉴定多种RNA修饰,无需经过冗长的亚硫酸氢盐转化或抗体沉淀操作。这些特点,再结合GridION X5和PromethION平台所提供的规模上的可扩展性,借用印第安纳大学伯明顿分校Marinov博士的话,纳米孔测序成为了 “转录组研究中最令人兴奋的发展”。

 
   

纳米孔测序技术最新技术动态

   
 

R10 纳米孔

R10 是一个新纳米孔设计,预期在2019年早些时候发布。R10版纳米孔的“桶身”更长,具有两对Reader heads。 更多的碱基主宰信号以达到更高的准确度,尤其是在均聚物(由一种单体聚合成的)方面。碱基质量值是衡量测序质量的重要指标,质量值(Q)越高代表碱基被测错的概率越小。在内部测试中,以75x覆盖度,新的R10纳米孔能够提供质量值>Q40以及一致性(identity)质量值Q50 。

图,新R10纳米孔

 

Flip-flop 碱基识别软件

新的碱基识别软件“Flip-flop”为R9的共有序列一致性提供了大的提升——重新识别现有数据可取得Q37。该软件在2018年12月中旬通过Guppy软件发布。Guppy是Oxford Nanopore提供的一款生成碱基识别软件,经过优化,可与碱基识别加速器一起运行。

 

测序芯片更新:Rev D版本

2018年10月,Oxford Nanopore发布了全新版“Rev D”ASIC的MinION和GridION测序芯片。新版本延长了测序芯片可用于DNA测序或RNA测序的时间,将DNA序列数据的总产量提高到每个测序芯片可高至30 Gb。在此性能下,相当于500美元即可测序覆盖度为10x的人类基因组。

自纳米孔测序技术推出以来,单个测序芯片可产生的测序数据量不断剧增。此前的产量增长受到了各种技术要素的推动,包括提高DNA片段通过纳米孔的速率,从推出时的每秒35个碱基提升到现在每秒450个碱基。此外还包括发布了测序设备控制软件MinKNOW的更新版本:用户界面更友好; 新功能支持更高数据产出;“电压控制”更好地适应实验,保持信号的一致性;更新核心API(应用程序编程接口);任务时间表使用户能够迅速检查文库质量和污染情况,根据喜好决定是否停止运行、清洗芯片、再次运行。并发布新版试剂盒LSK109,可在单个试剂盒中实现读长长度和产量最大化。

 

PromethION x24 和 PromethION x48设备

在2019年将发布两个新版的PromethION设备:24张测序芯片的 x24版, 以及48张测序芯片的x48版。当前最佳的PromethION用户运行已经非常接近150Gb 每张芯片,产量中位数为~60Gb。目前的内部记录为220Gb每张芯片,运行全部24张芯片为3.8 Tb。意味着一台可启用48张芯片的设备应能够交付7Tb数据。

图, 新版PromethION x24 和 PromethION x48

 

MinION Mk1c

MinION Mk1c 是一个集MinION测序仪、便携式分析仪MinIT 和一个屏幕为一体的设备,可通过WiFi/蓝牙和SIM卡连网。MinION Mk1c 正在进一步的研发中。

图,MinION Mk1c

参考链接:

1. https://www.nature.com/articles/nbt.4109

2. https://www.nature.com/articles/s41467-018-07885-5

3. https://www.nature.com/articles/nbt.4060

4. https://www.cell.com/molecular-plant/pdf/S1674-2052(18)30308-3.pdf

5. https://erj.ersjournals.com/content/52/suppl_62/PA5308

6. https://nanoporetech.com/about-us/news/longer-and-longer-dna-sequence-more-two-million-bases-now-achieved-nanopore

7. https://www.biorxiv.org/content/early/2018/11/09/459529

8. https://nanoporetech.com/about-us/news/oxford-nanopore-releases-rev-d-flow-cells-enabling-increase-data-yields

 

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