新冠病毒核酸检测如何避免“假阴假阳”?

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文章 | 菁良基因  编辑 | Shawne  关键词 | 核酸检测

 

最近,国药集团新冠灭活疫苗(Vero细胞)和康希诺重组新冠疫苗(5型腺病毒载体)获批上市,至此,国内已有4款新冠疫苗获批上市,目前全球已有近10款新冠疫苗获批上市。一些发达国家以高出本国人口几倍的数量订购新冠疫苗,而一些低收入国家尚无能力购买足够的疫苗,这意味着即便有了疫苗,由于不同国家之间的接种率的不同,新冠病毒仍然会继续存在。

目前我国已经进入了疫情的防守期和最后扑灭阶段,截至2021年2月9日24时,国内累计报告接种疫苗4052万剂次,由于全国人口数量大,大部分人群还无法获得新冠病毒免疫。新冠肺炎或将长期流行,病毒变得更加狡猾:新的病毒变种导致传染性增加、无症状感染、超级传染等情况都将给我们疫情防控带来更大的挑战。

新冠病毒核酸检测是新冠肺炎确诊的金标准,但核酸阴性不代表真阴性,核酸阳性也可能是假阳性。

新冠病毒核酸检测为何会“假阴假阳”?

■ 假阴性原因

1.未规范采集样本;

2.不同的病期在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异,可能导致所采集的标本中没有足够量的病毒;

3.样本内的病毒含量未达到检测试剂的检测限;

4.实验室质量管理落实不到位,仪器设备性能、实验人员是否规范操作、结果判读和质量控制等都是影响检测结果是否准确可靠的关键因素;

5.若样品保存、运输条件不佳或存放时间过长,模板RNA容易降解;

■ 假阳性原因

1.扩增产物将标本或反应管污染;

2.PCR 仪器的性能差异和温控不准等质量问题造成非特异性扩增;

如何避免新冠检测的“假阴假阳”?

■ 检测规范化重要性

目前截止2021年2月10日,国家食品药品监督管理局已批准56个新型冠状病毒检测试剂盒上市,不同检测试剂盒的靶序列设计不同。实验室需明确所使用的假病毒质控品包含RT-PCR扩增试剂检测的靶基因,因不同检测方法学及试剂盒针对的基因及靶序列各异,推荐使用包含新冠病毒全基因组的质控品,确保所使用的质控品适用实验室所采纳的检测技术及试剂盒

参考国务院应对新冠肺炎疫情联防联控机制医疗救治组《关于加强外送样本新冠病毒核酸检测质量管理工作的通知》中进一步明确:“每批次检测时,应当随机放入至少1份弱阳性(1.5-3倍检测限)和3份阴性室内质控样本,进行质量控制,以及时发现问题,避免假阴性和假阳性”,进一步强化了新冠核酸检测实验室质量控制的要求。”

为指导各地规范开展大规模新冠病毒核酸检测工作,保障检测效率和质量,有效控制新冠肺炎疫情,国家卫生健康委组织制定的《大规模新冠病毒核酸检测实验室管理办法(试行)》中也明确规定:大规模检测实验室应当按照有关规定,每批次检测时,随机进行弱阳性和阴性室内质控,并定期参加国家或省级组织的室间质评。另外当大规模检测实验室出现以下情形时,卫生健康行政部门不再允许其承担检测任务:1.在质量监督过程中发现检测不规范,可能影响检测质量的;2.在检测过程中未开展室内质控,未参加室间质评的;

3.室间质量评价连续两次以上不合格,经整改后仍不合格的;

■ 样本采集质控重要性

样本采集作为核酸检测的第一步,其中涉及的采样耗材和病毒保存液的质量保证对检测结果的准确性至关重要,不合格样本会直接影响检验结果。在新冠病毒核酸检测中,不合格样本通常是由于采样问题和采样用具问题导致的。

合格的病毒保存液目前主要要求两点:

1.保证病毒的充分灭活,防止采样、运输和检测过程的感染风险。

2.保证病毒核酸(RNA)在采集、运输过程中的稳定性,保证检测结果的准确性,防止样本运输保存过程中降解导致检测的“假阴性”。

根据《ISO 15189:2012 医学实验室质量和能力认可准则》第5.3.2.3“试剂和耗材-验收试验”明确规定:影响检验质量的耗材应在使用前进行性能验证,灭活型保存液对病毒核酸保存能力不同,除了厂家提供核酸保存能力性能报告之外,使用者应对所选择的保存液进行性能验证。

《新冠病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》中关于采样管选择要求:“人群筛查应选择具有病毒灭活功能如含胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍等)或表面活性剂的采样管。首选含胍盐的采样管。发热门诊或急诊的快速检测,则根据所用的核酸检测试剂的要求确定采样管。”

工作手册中对采样管的要求主要考虑病毒的充分灭活(安全性),但是在灭活病毒的同时,我们还应考虑所选用的采样管中的病毒保存液成分能否稳定保存病毒核酸的完整性,避免样本中的核酸在检测前降解造成“假阴性”。

此外,如果病毒保存液中的成分会对后续的提取或PCR反应造成抑制,也有可能造成核酸检测“假阴性”。

因此,采样环节的质控也需要引起行业关注。

菁良基因COVID-19假病毒全基因组质控品

菁良自去年疫情爆发以来第一时间就推出了新冠系列质控品,并一直不断完善升级,此次推出的COVID-19 假病毒全基因组质控品,其产品形式为冻干珠,可以直接溶解于实验室采样管的病毒保存液或样本释放剂中,从采样环节开始,实现真正意义的全流程质控。 

行业内知名第三方医学检测公司为了验证市场上主流采样管的质量,通过使用菁良的COVID-19假病毒全基因组质控品做了相关对比实验。将COVID-19假病毒全基因组质控品直接加入三个不同厂家生产的采样管中,充分混匀后取200μL溶液进行提取和后续的RT-qPCR检测,重复测试两次取Ct值均值,结果显示厂家C的实验结果均为阴性,说明厂家C的产品不适用于2019-nCov核酸检测流程的采样环节。

*ORF1ab、N基因和内参基因的Ct值均≤40时样本检测结果判读为阳性

■ 产品信息

产品编号GW-CRBM001
产品名称COVID-19 假病毒全基因组质控品
目标区域COVID-19病毒全基因组
产品形式假病毒冻干珠
产品规格10颗/盒或100颗/盒

■ 更多产品特点

覆盖更全面的检测区域:覆盖病毒全基因组序列,可以适配市场上已获批的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

冻干珠的产品形式更稳定:可以更好地保证假病毒结构和病毒核酸(RNA)的稳定性,运输存储的条件也更加便利(常温下运输,2-8℃保存,高温(55℃)下可稳定保存长达1周)。

质控品的拷贝数浓度可灵活配制:通过ddPCR精确定量2019n-Cov病毒基因组拷贝数,可根据不同实验室使用的核酸检测试剂盒的检测限和弱阳性质控品的需求(1.5-3倍检测限)参考配制特定拷贝数浓度的质控品溶液,用于核酸检测的日常质控。

病毒核酸检测弱阳性:经验证,菁良COVID-19假病毒全基因组质控品溶解后进行病毒RNA提取,分别使用5款获证的市场主流RT-qPCR试剂盒检测ORF1ab基因,各试剂盒检测ORF1ab基因的结果为弱阳性(Ct值在33~37之间)。

重视新冠病毒核酸检测质量控制工作,使核酸检测既保“量”又保“质”,才能为常态化疫情防控工作提供有力的技术支持。

 关于菁良基因 

菁良作为国内分子诊断标准品研发生产商领跑者,拥有全球接受及使用范围最大的标准品研发生产平台,累积近千细胞系资源,能够持续稳定地为用户提供预期和满意的合格产品。

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